1895年1月14日，出生在江苏省清河县清江浦（在今淮安市境），名士楚，字信芳，出身梨园世家，祖籍浙江省宁波府慈谿县慈城镇（今属宁波市江北区）。
自六歲起学习京剧，七岁時在杭州登台演娃娃生，艺名“七龄童”。
1907年，在上海演出时傳單誤植为“麒麟童”，其後便一直沿用。
11歲起學習譚鑫培派老生。
1908年，到北京的科班「喜連成」做帶藝入科（帶藝搭班邊學邊演）實習演員。
和马连良并称“南麒北马”，被视为三十年代以来活跃于京剧舞台上的，最全面两位表演艺术大师。
1909年，周信芳到俄羅斯巡迴演出。
在抗日战争期间，他在上海排演《文天祥》、《徽钦二帝》、《明末遺恨》等新戏，以激发人们的爱国心，亦惹怒了汪精衛政府。
1949年10月1日，中華人民共和國成立，與梅蘭芳、程硯秋等幾位戲曲界代表，在天安門城樓上參加了開國大典。
1950年起歷任上海市文化局戏曲改进处处长、华东戏曲研究院院长兼华东京剧实验学校校长（1951年起）、全国人民代表大会代表（1954年起，連任3屆）、上海京剧院院长（1955年起，創院院長）等公職，並在1959年7月1日參加中國共產黨。
1960年代後，他與當權派產生種種意見上的分歧，他編演的現代京劇（京劇現代戲）《楊立貝》未獲准上演，他做上海京劇院院長，指斥江青動員全院人力物力排演實驗性的「革命現代京劇」《智取威虎山》、《海港》是勞民傷財，反應時事的新戲（新編古裝京劇《海瑞上疏》）更成為他的罪狀書。
在文化大革命中遭到清算，1968年3月24日被捕入獄；一年後被軟禁在家中，直到1975年心臟病發逝世。
直到死後始獲得平反，1978年8月16日在上海舉行了周信芳的遗骨安葬儀式。骨灰供奉於上海龍華革命公墓，後與第二任妻子裘麗琳合葬。
