1901年2月28日，出生北京。父马西园，是一茶馆业主，与著名京剧演员谭小培熟识。

1908年，入喜连成科班（后改名富连成）。

1913年，成为科班主力。

1917年，出科后在福州演出京剧《珠帘寨》。

1918年，再入富连成科班继续深造。

1921年，初次赴上海演出，表演《问樵闹府》《南阳关》等剧目。

1922年12月，应邀加入玉华社。

1923年，开始整理、改编传统剧目，进行京剧改革。

1925年，演出整理改编的京剧新戏《广泰庄》《化外奇缘》等。

1927年，自组春福社，正式挂头牌。

1928年，推出独有剧目《大红袍》《应天球》等。

1929年，首演京剧《许田射鹿》。

1930年，成立“扶风社”。

1931年，改编重排京剧剧目《苏武牧羊》。

1936年，其改编的京剧《胭脂宝褶》首演。

1938年，改编并演出反抗异族压迫的京剧《串龙珠》。

1939年，首演抗敌御侮主题的京剧《春秋笔》。

1942年，改编创作京剧《十老安刘》。

1947年，演出《群英会·借东风》《四进士》等剧目。

1948年，赴香港演出。

1951年，返回广州，与张君秋组成中南联谊京剧团。

1952年，排演新编历史剧《将相和》。

1953年，赴朝鲜参加战场慰问演出。

1955年，担任北京京剧团团长。

1958年，排演京剧《赤壁之战》。

1961年，演出新编历史剧《海瑞罢官》。

1966年，在“文化大革命”中被迫害致死。在文化大革命中被抄家与关进牛棚里，马连良曾与老舍、萧军、荀慧生、白芸生等一起被批斗，当场剃成阴阳头，墨汁淋在脑袋上，围跪在大火四周，一面灼烤，一面用钢头皮带抽头，并拳打脚踢，个个头破血流。1966年12月13日，因意外摔倒被送至北京阜外医院，3天后不治。